次世代シーケンシングの基盤

最初のステップとしての核酸抽出

抽出とは、DNAまたはRNAのサンプルを生物学的マトリックスから取り出す最初の工程であり、これによりその後の下流処理が円滑に行われるようになります。この重要な工程は、抽出される核酸の収量や純度に影響を与えるだけでなく、断片サイズにも大きな影響を及ぼし、NGSの応用範囲を決定づけ、シーケンシングライブラリの品質を左右します。 これらのサンプルの純度は、シーケンシング結果の信頼性にとって極めて重要であり、最適な実験装置や手法への投資がいかに重要であるかを浮き彫りにしています。

核酸抽出の効率は、生物学的試料から得られるDNAまたはRNAの収量を決定します。高収量は、下流の用途に向けた遺伝物質の十分な供給を保証する一方、純度は、シーケンシング結果を歪める可能性のある不純物が存在しないことを示しています。収量と純度を最大化し、正確なシーケンシングのための遺伝物質の完全性を確保するために、厳格な抽出プロトコルが採用されています。 さらに、ショートリードとロングリードのシーケンシング手法の選択は、特定の用途に合わせてライブラリ調製プロトコルを最適化することの重要性を示しています。抽出の過程で、DNAやRNAの意図しない断片化が発生することがあり、これがシーケンシングライブラリ内の断片サイズの分布に影響を及ぼします。

シーケンシング法がライブラリ調製に及ぼす影響

選択したシーケンシング技術によって、通常50～300 bpの断片を対象とするショートリードシーケンシング、あるいは最大Mbpの断片を含むDNA分子全体を対象とするロングリードシーケンシングのいずれかに応じたライブラリ調製プロセスが決定されます。断片サイズは、シーケンシングへの適性を左右するため、NGSライブラリ調製において極めて重要な役割を果たします。 断片化方法やインキュベーション時間などの要因を制御することで、抽出プロトコルを調整し、シーケンシング結果を最適化するために所望の断片サイズを得ることができます。

さらに、ライブラリ調製のワークフローや必要な手順は、応用分野や核酸の種類（DNAまたはRNA）によって異なります。 ターゲットシーケンシングはゲノムの特定の領域に焦点を当てるため、データ解析の範囲を限定すると同時に、時間とコストを削減します。ゲノムのより小さく特定の領域に焦点を当てることで、はるかに高いカバレッジでのシーケンシングが可能になります。 したがって、ターゲットシーケンシングでは、ゲノムから特定の遺伝子断片または遺伝子パネルを増幅する必要があります。対照的に、全ゲノムシーケンシング（WGS）は、PCR増幅産物による潜在的なバイアスなしに全ゲノムの包括的な全体像を提供し、より幅広い用途に適しています。

Biometraのサーマルサイクラーは、NGSライブラリ調製の要件に最適です。さまざまなモデルやブロックモデルにより高い柔軟性を備えており、Biometraのサーマルサイクラーは、さまざまなサンプル処理能力やワークフローのニーズに対応しています。また、市販されているほぼすべてのPCR用プラスチック製消耗品に対応しています。 特に、Biometra TAdvancedサーマルサイクラーは、10x Genomics社によって、単一細胞レベルおよび空間分解能のあるサンプルにおける同社のすべての革新的な手法との互換性が検証され、推奨されている市場で唯一のPCRサイクラーであり、Biometra TAdvancedは将来を見据えた投資と言えます。 これらの重要な要素に対応することで、Biometraサーマルサイクラーは再現性を確保し、バイアスを最小限に抑え、収量を最適化することで、NGSライブラリ調製の効率と信頼性を向上させます。

サンプルの正規化とプーリング

ノーマライゼーションは、NGSライブラリ調製において極めて重要な工程であり、すべてのライブラリが均等に表現され、十分なリード深度でシーケンシングされることを保証します。これは、マルチプレクシングのための濃度を均一化し、サンプルの過大表現や過小表現を防ぐものです。過大表現はキャパシティの無駄につながり、過小表現はリード深度の低下やデータの損失を招き、貴重なサンプルを無駄にする恐れがあります。 したがって、ライブラリ濃度のノーマライゼーションを行うことで、費用対効果の高い方法で一貫性があり信頼性の高いNGSデータを生成することができます。

リソースを節約するために、複数のライブラリをプールして、同じランでシーケンシングを行うことができます。複数のサンプルからのシーケンシングライブラリを1つのランにまとめることで、フローセルの最適な利用が確保され、より経済的なプロセスとなります。